化学方法合成环四肽之酰肼环化

环四肽是一类重要的生物活性分子, 其独特的刚性 环状结构在药物研发中有着潜在应用。例如, 从 Lactobacillus helveticus 中分离得到的环(L-Pro-L-Tyr-L-Pro -L-Ile ) 四肽具有抑制酪氨酸酶的活性的作用。

化学方法合成环四肽

使用化学方法合成环四肽是将该类分子用于药物研究的第一步。 然而, 由于环四肽的结构中含有高度限制的 12元环, 使得通常具有平面结构的酰胺键被扭曲。结果导致环四肽具有较大的分子内张力, 造成其合成非常困难。使用常规方法将线性四肽进行环合, 即使在高度稀释的条件下, 也将主要生成分子间寡聚物, 而不是分子内环化产物。

为克服这一困难, 一般使用这几种特别的方法来合成环四肽。

（1）“假稀 释(pseudo dilution)”策略；

（2）引入“分子内构象辅助因子 (internal conformational elements)”策略；

（3）利 用“分子外构象辅助因子(external conformational elements)”促进环四肽的合成；

（4）四肽酰肼环化反应。

这四种方法中这里主要介绍第四种合成法。

四肽酰肼环化反应原理

其中四肽酰肼环化反应方法的原理是 C 端酰肼在 NaNO2 的活化条件下原位生成硫 酯, 通过分子内硫酯交换生成大环内硫酯, 再经过自发 的 S-to-N 酰基迁移得到环化产物。

四肽酰肼环化实验结果表明, 使用酰肼法 合成环四肽不仅可行, 而且操作非常简便、产率也较高, 因此是一种高效率合成环四肽的通用方法。

四肽酰肼环化实验的基本操作

根据各线性四肽酰肼的分子量, 用 pH 3.0的盐酸胍 磷酸盐缓冲液(6.0 mol/L Gn•HCl, 0.2 mol/L NaH2PO4)配 制 2.0 mmol/L 的溶液(比如 1 mL). 将溶液置于－10 ℃, 加入 10 equiv. NaNO2 (0.2 mol/L 水溶液, 100 μL), 氧化 20 min 后, 加入 40 equiv. MPAA (13.4 mg 溶于 0.9 mL 磷酸盐缓冲液中), 使反应终体积为 2 mL. 将 pH 调为 7.0, 室温反应 2 h. 用 HPLC 监测环化反应进度。

四肽酰肼 1a 浓度与环化效率实验

为了得到 1a 浓度与产率间的关系, 用 HPLC 纯化出 10 mg 1a 用于实验. 称取 2.4 mg 1a 溶于 0.5 mL pH 3.0 的盐酸胍磷酸盐缓冲液, 得到溶液 1 (8.0 mmol/L). 取出 0.25 mL 溶液 1, 加入 0.25 mL pH 3.0 缓 冲液, 得到溶液 2 (4.0 mmol/L). 用同样操作得到溶液 3 (2.0 mmol/L), 4 (1.0 mmol/L). 同理, 称取 1.8 mg 1a, 按 照相同方法配出溶液 5 (6.0 mmol/L), 6 (3.0 mmol/L), 7 (1.5 mmol/L), 8 (0.75 mmol/L). 再分别将这些溶液进行 环化实验。

四肽酰肼 1a 环化条件优化实验

配制 2.0 mmol/L 1a 溶液 6 mL, 平均分配到 6 个相 同的反应容器(4 mL 的 EP 管)中, 编号为 1', 2', 3', 4', 5', 6'. 将反应容器置于－10 ℃, 加入 10 equiv. NaNO2 (0.2 mol/L 水溶液, 100 μL), 氧化 20 min 后, 在管 1', 4', 5', 6' 中加入 40 equiv. MPAA (13.4 mg 溶于 0.9 mL 磷酸盐缓 冲液), 2', 3'分别加入 40 equiv. MesNa (13.1 mg 溶于 0.9 mL 磷酸盐缓冲液), PhSH (8 μL 溶于 0.9 mL 磷酸盐缓冲 液). 1', 2', 3'调 pH 至 7.0, 4', 5', 6'调 pH 分别为 6.0, 8.0, 9.0. 室温反应 2 h, 用 HPLC 监测环化反应进度。