运用片段对接法合成利拉鲁肽

利拉鲁肽(Liraglutide)是一种重要的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，于 2010 年被美国食

品药品监督管理局( FDA) 批准上市，用于治疗Ⅱ型糖尿病。

利拉鲁肽的结构如图 1 所示（赖氨酸 (Lys )侧链亲脂性基团(N-棕榈酰-γ-谷氨酸)的存在可以延长药物的半衰期）。

在利拉鲁肽固相全合成的实际操作中发现，N 端的第4个或者是第5个氨基酸常存在偶联不完全的情况。需过量投料，其效率不高，不利于纯化。

全保护片段缩合策略是对固相合成的一种补充，但对于片段较长的情况，又存在全保护肽溶 解性差、反应效率低的问题。

丝氨酸/苏氨酸对接法

丝氨酸/苏氨酸对接法是在常规化学连接策略的基础上发展起来的一种片段对接方法。

与常规化学连接依赖硫酯和半胱氨酸(Cys)侧链巯基(-SH)的特异性反应不同；丝氨酸/苏氨酸对接法主要依靠丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)侧链羟基与醛基的亚胺捕获反应实现连接。

该方法的原理是将一个组分的C端转化为水杨醛酯再与另一组N端丝氨酸/苏氨酸反应，所得中间体经酸处理；N，O-苯亚甲基乙缩醛部分发生开环，脱去缩醛，变成肽键得到目标产物。目前，这一策略主要应用于糖肽、核蛋白及一些环状肽的制备。

利用苏氨酸对接法实现利拉鲁肽片段组氨酸甘氨酸 ( His -Gly) 与片段苏氨酸-甘氨酸 (Thr -Gly)的连接，合成了利拉鲁肽的主链。先通N-芴甲氧羰基甘氨酸水杨醛酯(Fmoc-Gly-OSAL) 与苏氨酸苯甲醇酯(H-Thr-OBzl)的模板反应优化了苏氨酸对接反应的条件，发现以醋酸/吡啶为溶剂时，底物转化效率高。

研究了利拉鲁肽片段对接的2种路线：

①先片段连接再进行侧链修饰；

②先修饰再进行片段连接。

研究发现先进行片段对接，再进行侧链修饰的路线效率更高，室温下反应4 h底物可完全转化，中间体经三氟乙酸(TFA)处理，一步完成开环与保护基的脱除，对接收率达 76. 4%。接着对 Lys侧链(N-棕榈酰-γ-谷氨酸)的修饰反应进行研究，发现在 pH=10～12的水/乙腈溶液中反应时，能以较高的产率获得目标修饰产物。

1.

先片段对接，再进行侧链修饰

将其序列分割为全保护片段叔丁氧羰基-组氨酰(三苯甲基)-丙氨酰-谷氨酰(叔丁基)-甘氨酸［Boc-His(Trt)-Ala-Glu(tBu)-Gly-OH］和脱保护片段Thr-Gly，分别进行合成。将全保护片段4的C端修饰为水杨醛酯，与片段6的N端Thr进行对接。Lys侧链修饰。

全保护肽Boc-His(Trt)-Ala-Glu(tBu)-Gly-OH合成:

以2-氯三苯甲基氯(CTC)树脂为载体，采用芴甲氧羰基(Fmoc)策略进行固相合成。在 DCM/AcOH体积比为95：5的条件下进行裂解，减压蒸除溶剂，得到油状物1。

脱保护肽段Thr-Gly的合成:

以Wang树脂为载体，采用Fmoc策略进行固相合成，在TFA/TIS/H2O体积比为95∶2.5∶2.5的条件下进行裂解，将反应液加入冰乙醚中沉降，得到白色固体3。

四肽水杨醛酯的合成:

将化合物1溶于DCM中，加入DMAP、DIC、水杨醛和无水硫酸钠，于30℃下搅拌反应约4h过滤除去固体，滤液减压蒸干，残余物经硅胶柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚体积比为1∶5～4：1),得白色固体2。

按图示路线合成化合物4～6。

对接中间体的合成:

将化合物2溶于醋酸/吡啶(摩尔比 3∶1)混合溶液中，加入肽段3，室温下搅拌反应约4 h。冷冻干燥除去溶剂，得粗产品油状物4，不经纯化，直接用于下一步反应。

线性肽组氨酸甘氨酸(His-Gly)的合成:

将化合物4粗产品溶于TFA/TIS/H2O(体 积比95∶2.5∶2.5)混合溶液中，室温下反应 40 min；反应液经半制备高效液相色谱(HPLC)纯化(乙腈/水)，冷冻干燥得白色粉末5。

利拉鲁肽的合成:

Pal-Glu-OtBu与N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)的酯化，得白色固体N-棕榈酰-谷氨酸(γ-琥珀酰亚胺酯)叔丁酯［Pal-Glu(OSu)-OtBu]，不用纯化直接使用。

将化合物5溶于水/乙腈(体积比3∶1)混合溶液中，加入DIEA调节溶液pH10～11。将Pal-Glu(OSu)-OtBu溶于乙腈中，逐滴加入到上述溶液中，滴加完毕，继续反应30 min。冷冻干燥除去溶剂，残余物溶于TFA /H2O(体积比95∶5)混合溶液中，室温下反应 30 min。经半制备 HPLC纯化(乙腈/水)，冷冻干燥得白色粉末6，即利拉鲁肽。

2.

先修饰后连接合成利拉鲁肽

利拉鲁肽侧链修饰反应

Lys的侧链氨基与Pal-Glu(Osu)-OtBu进行偶联反应得到中间体，中间体经酸处理脱除tBu保护基。由于精氨酸的侧链胍基(pKa =12.5)有较强的碱性，可控制体系的pH在10～11范围内，使其质子化，不与OSu酯发生反应; 序列中的其它碱性基团，如N端氨基(pKa=9.5)，其亲核性低于 Lys20侧链氨基(pKa=10.5)，因此偶联反应会优先发生在 Lys侧链。

Thr-Gly侧链修饰产物4的合成:

将化合物3溶于水/乙腈(体积比3∶1)混合溶液中，加入 DIEA 调节溶液pH10～11。将 Pal-Glu(OSu)-OtBu溶于乙腈中，逐滴加入到上述溶液中，滴加完毕，继续反应 30 min。经半制备 HPLC 纯化(乙腈/水)，冷冻干燥得白色粉末。

对接中间体5的合成:

将化合物2和四肽水杨醛酯溶于醋酸/吡啶(摩尔比3∶1)混合溶液中，室温下反应6 h．冷冻干燥除去溶剂，得粗产品油状物5，不用纯化，直接用于下一步反应。

利拉鲁肽的合成:

将化合物5粗产品溶于TFA /TIS /H2O(体积比95∶2.5∶2.5)混合溶液中，室温下反应 30 min;反应液经半制备HPLC纯化(乙腈/水)，冷冻干燥得白色粉末产物利拉鲁肽。