多肽检测样品提取有新方法

在生物分析中，多数样品在通过液相色谱-质谱(LC-MS) 分析之前都需要进行一些样品的制备。通过去除干扰基质或通过样品中分离出目标化合物来进行分析，制备样品已经成为生物化学分析的一个重要步骤。近期，挪威奥斯陆大学一研究团队多肽的样品制备进行研究，并将研究结果以“Electromembrane extraction of peptides using deep eutectic solvents as liquid membrane”为题发布在《Analytica Chimica Acta》。

目前的研究手段中，常见的样品制备技术包括液相萃取 (LLE)、固相萃取 (SPE) 和蛋白质沉淀(PP)。过去在样品制备的研究中，重点一直在提取技术的小型化方面，而现在对于更环保的样品制备方法的巨大需求也推动了小型化技术的发展。通过将将 LLE 和 SPE 等成熟技术小型化，可以减少有机溶剂的含量，同时可以预浓缩目标化合物，达到环保的目的。

在肽的电膜萃取(EME)中，以前使用的支撑液膜(SLM)并不是最佳的，并且其电流过大而导致的中等回收率和稳定性问题也一直存在。目前肽的EME 的 SLM 主要由长链醇组成，并添加了离子载体磷酸二(2-乙基己基)酯 (DEHP) 。

在该项研究中，研究人员使用低共熔溶剂(DES)提取肽。研究了集中具有高氢键和阳离子-π 相互作用能力的疏水性和非离子 DES。使用DES 作为纯溶剂进行测试，以研究氢键和阳离子-π 相互作用对肽分配和转移到 SLM 的影响。此外，研究人员使用离子载体测试了 DES 以研究离子相互作用的影响。实验仅限于纯水性样品溶液，并侧重于了解主要的分子相互作用。这种类型的基础知识是未来开发肽EME方法的第一步。

在试验中，通过将每种肽溶解在去离子水中来制备1.0mg mL -1模型肽的单独储备溶液。通过添加每种肽的1.0 mg mL -1储备溶液并用去离子水稀释至终浓度为50 μg mL -1来制备包含所有16种模型肽的工作溶液。储备液和工作液保存于-20 ℃避光。EME 的样品溶液通过用适当的样品基质(磷酸、磷酸盐缓冲液)稀释 50 mg mL -1工作溶液至最终肽浓度为 1.0 μg mL -1 来制备。在每次 EME 实验之前，样品溶液都是新鲜制备的。EME 是用等体积的样品和受体进行的，因此没有获得富集。

所有实验均使用 16 种不同的肽作为模型分析物进行。这些是相对较小的肽，范围从 3 到 13 个氨基酸，它们的分子特性总结在表 1 中。精心选择肽以代表不同的极性、电荷特性和等电点。在这项非常基础的工作中，提取是从缓冲水溶液中进行的。样品和受体溶液均通过 LC-MS/MS 进行分析，以确定每种肽的质量平衡、回收率和精度。根据之前肽的 EME 标准，超过 40% 的回收率被认为是可以接受的，当回收率高于85%时，萃取被认为是彻底的

通过研究，该团队首次证明了具有DES的肽的EME作为SLM。DES是疏水的和非离子的，以在提取过程中保持 SLM 的完整性和低电流。尽管纯 DES 是氢键和阳离子-π 相互作用的强溶剂，但它们对 16 种选定模型肽的提取效率低下。然而，通过向 DES 添加离子载体 (DEHP)，可以有效提取 14 种肽。香豆素与百里酚混合发现含有 2.0% (v/v) DEHP 的 (1:2) 是最有效的 SLM。这种 SLM 对所有没有酸性残基的模型肽以及碱性比酸性残基强的模型肽都是有效的。提取动力学相对较慢，特别是对于具有多个正电荷和疏水残基的最大模型肽。这些模型肽被困在 SLM 中，但这可以通过增加提取时间来规避。

基于 DES 的 SLM 比已发表的 SLM 更有效，可能是由于内在疏水性低。研究性能和与生物流体相容性的实验正在进行中。这些将增加对分子相互作用的认识和理解，研究复杂样品基质的影响，并有可能使 EME 成为未来肽生物分析的强大工具。

参考文献：Torstein Kige Rye, Gordana Martinovic, Linda Vårdal Eie, Frederik André Hansen, Trine Grønhaug Halvorsen, Stig Pedersen-Bjergaard,Electromembrane extraction of peptides using deep eutectic solvents as liquid membrane,Analytica Chimica Acta,Volume 1175,2021,338717,ISSN 0003-2670.